|
|
Vývoj a implementace nových přístupů umožňujících proteomickou charakterizaci kostních tkání ve stomatochirurgii
Michalus, Iva ; Hynek, Radovan (vedoucí práce) ; Šebela, Marek (oponent) ; Hrabal, Richard (oponent)
1 Abstrakt Proteomika je bouřlivě se rozvíjející obor, který nachází uplatnění v mnoha oblastech medicíny, včetně stomatologie. Přesto proteomická charakterizace kostních tkání ve stomatochirurgii není stále běžně využívána. Hlavní příčinou je značná komplikovanost používaných analytických přístupů, která vyplývá z nerozpustného charakteru kostních tkání. Cílem této práce bylo vyvinout a aplikovat přímočarou metodiku, která by mohla vést k rutinnímu využití proteomiky i v této oblasti. Nejprve byla s využitím prasečích čelistních kostí jako modelových vzorků vyvinuta technika umožňující identifikovat až stovky proteinů díky jejich štěpení trypsinem přímo v kostních tkáních ("in-bone digestion") následovaného analýzou pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie s předřazenou kapalinovou chromatografií (LC-MS/MS). Tato technika byla následně aplikována na analýzu odoperovaných tkání lidských maxilárních a mandibulárních kostních tkání. Jak ve vzorcích maxilárních, tak mandibulárních kostí, bylo možné technikou přímého štěpení identifikovat značné množství proteinů. Navíc matematická analýza získaných dat umožnila též rozlišit mezi tkáněmi postiženými zánětem a zdravými tkáněmi. Přístup založený na přímém štěpení byl následně úspěšně rozšířen též na analýzu in vitro modelů lidských kostních tkání. Přímé štěpení...
|
|
|
Proteomická analýza inženýrované hyalinní chrupavky
Kaňovská, Zuzana ; Vičarová,, Petra (oponent) ; doc. RNDr. Irena Koutná, Ph.D (vedoucí práce)
Cílem této diplomové práce bylo sledovat expanzi chondrocytů, specializovaných buněk chrupavky, in vitro v kultivačním médiu s obsahem plazmy bohaté na krevní destičky, zhodnotit vliv přídavku růstových faktorů TGF-1 a IGF-1 do média a prozkoumat možnosti aplikace proteomické analýzy ve vývoji chrupavkových kloubních náhrad. Chondrocyty byly izolovány ze vzorků kloubních hyalinních chrupavek získaných ve spolupráci s FN Brno a expandovány v médiích. Vzniklé konstrukty byly následně analyzovány pomocí imunocytochemické metody, průtokové cytometrie a proteomické analýzy s využitím LC-MS/MS.
|
|
|
Molecular events associated with resistance to tyrosine kinase inhibitors in leukemia cells.
Hrdinová, Tereza
Chronická myeloidní leukémie (CML) je myeloproliferativní onemocnění hematopoézy charakterizované expresí konstitutivně aktivní tyrozin kinázy BCR-ABL. Ačkoli vývoj tyrozin kinázových inhibitorů (TKI) jako je imatinib zásadním způsobem zefektivnil léčbu CML, u určité skupiny pacientů vzniká rezistence na TKI léky. Nejčastější příčinou rezistence jsou bodové mutace v genu BCR ABL1, méně pak i další na mutaci nezávislé mechanismy. Růst rezistentních CML buněk v přítomnosti TKI léků je důsledkem adaptivních změn v jejich metabolismu. Rezistence může být udržována vnějšími signály, mezi nimiž sehrávají důležitou roli exozomy, malé membránové vezikuly uvolňované (rezistentními) buňkami. Cílem této práce bylo proteomicky charakterizovat dvě buněčné linie CML (senzitivní a rezistentní na imatinib) a také exozomy, produkované rezistentními buňkami. Identifikace metabolických drah esenciálních pro růst rezistentních buněk v prostředí imatinibu umožňuje zacílit jejich metabolismus klinicky dostupnými léky, což nabízí potenciál pro jejich využití v (personalizované) léčbě. Proteomickou analýzou exozomů z rezistentních buněk lze identifikovat specifické povrchové membránové proteiny využitelné jako klinicky relevantní diagnostické markery rezistence na imatinib. Pro tyto účely byly vyvinuty a analyzovány dvě...
|
|
|
Molecular events associated with resistance to tyrosine kinase inhibitors in leukemia cells.
Hrdinová, Tereza ; Vyoral, Daniel (vedoucí práce) ; Klener, Pavel (oponent) ; Holoubek, Aleš (oponent)
Chronická myeloidní leukémie (CML) je myeloproliferativní onemocnění hematopoézy charakterizované expresí konstitutivně aktivní tyrozin kinázy BCR-ABL. Ačkoli vývoj tyrozin kinázových inhibitorů (TKI) jako je imatinib zásadním způsobem zefektivnil léčbu CML, u určité skupiny pacientů vzniká rezistence na TKI léky. Nejčastější příčinou rezistence jsou bodové mutace v genu BCR ABL1, méně pak i další na mutaci nezávislé mechanismy. Růst rezistentních CML buněk v přítomnosti TKI léků je důsledkem adaptivních změn v jejich metabolismu. Rezistence může být udržována vnějšími signály, mezi nimiž sehrávají důležitou roli exozomy, malé membránové vezikuly uvolňované (rezistentními) buňkami. Cílem této práce bylo proteomicky charakterizovat dvě buněčné linie CML (senzitivní a rezistentní na imatinib) a také exozomy, produkované rezistentními buňkami. Identifikace metabolických drah esenciálních pro růst rezistentních buněk v prostředí imatinibu umožňuje zacílit jejich metabolismus klinicky dostupnými léky, což nabízí potenciál pro jejich využití v (personalizované) léčbě. Proteomickou analýzou exozomů z rezistentních buněk lze identifikovat specifické povrchové membránové proteiny využitelné jako klinicky relevantní diagnostické markery rezistence na imatinib. Pro tyto účely byly vyvinuty a analyzovány dvě...
|
|
|
Proteomická analýza v hematologickém výzkumu: identifikace alfa2-makroglobulinu jako specifického vazebného proteinu pro hormon hepcidin a změny proteomu leukemických buněk K562 v průběhu indukované diferenciace butyrátem sodným.
Pešlová, Gabriela ; Vyoral, Daniel (vedoucí práce) ; Krijt, Jan (oponent) ; Suttnar, Jiří (oponent)
Dizertační práce: "Proteomická analýza v hematologickém výzkumu: identifikace alfa2-makroglobulinu jako specifického vazebného proteinu pro hormon hepcidin a změn proteomu leukemických buněk K562 v průběhu indukované diferenciace butyrátem sodným" je postavena na proteomickém přístupu k identifikaci a funkční charakterizaci proteinů, které se účastní transportu hormonu metabolismu železa, hepcidinu v krevní plazmě a které se uplatňují při erytroidní diferenciaci modelových buněk linie K562. V první části se jedná o proteomické využití nedenaturujících, nativních separačních metod, zejména chromatografie a nativní elektroforézy, ve druhé části pak o porovnání proteomu kontrolních a butyrátem indukovaných buněk pomocí klasické techniky - dvojrozměrné SDS polyakrylamidové elektroforézy. Metody použité v dizertaci rozšiřují spektrum technik použitelných v experimentální hematologii. Dizertace spolu s publikovanými články pak přináší poznatky o nových proteinech důležitých pro metabolismus železa a diferenciaci červených krvinek. Klíčová slova: proteomická analýza, hepcidin, alfa2-makroglobulin, metabolismus železa, CML, K562, Na-butyrát
|
|
|
Morfiem navozené změny membránových a solubilních bílkovin frontální mozkové kůry potkana
Ujčíková, Hana
Cílem této dizertační práce bylo analyzovat změny indukované morfiem ve složení proteinů frontální mozkové kůry potkanů vystavených zvyšujícím se dávkám morfia po dobu 10 dní (10-50 mg/kg). První část práce byla zaměřena na fenomén superaktivace/hypersenzitizace adenylylcyklázy (AC), který je považován za jeden z klíčových molekulárních mechanismů podílejících se na vzniku patologických důsledků drogové závisloti. Vzestup aktivity AC představuje kompenzační odezvu funkčně spojenou se snížením odpovědi G proteinů vlivem dlouhodobé expozice morfiu. Výsledky naší pracovní skupiny již dříve prokázaly desenzitizaci odpovědi G proteinů při stimulaci opioidních receptorů (OR) agonisty DAMGO (µ-OR) a DADLE (δ-OR). Funkční aktivita G proteinů byla měřena pomocí vazby [35 S] GTPγS ve frakcích plazmatických membrán (PM) izolovaných z frontální mozkové kůry potkanů vystavených zvyšujícím se dávkám morfia podle stejného protokolu, jaký je uveden v této práci (10-50 mg/kg, 10 dní). κ-OR-stimulovaná vazba [35 S] GTPγS se nezměnila. Byl stanoven obsah všech typů izoforem AC (AC I-IX) ve frakcích PM izolovaných z potkanů ovlivněných morfiem a kontrolních zvířat usmrcených 24 hodin po aplikaci poslední dávky. Imunoblotová detekce byla provedena s využitím specifických protilátek orientovaných proti AC I-IX. Byl...
|
|
|
Oxidace proteinů a lipidů u ryb: dráhy, kinetika a produkty
HEMATYAR, Nima
Rybí svalovina obsahuje omega-3 mastné kyseliny, vysoce kvalitní bílkoviny a další cenné živiny. Na druhé straně představuje rybí svalovina velmi rychle se kazící potravinu díky vysokému obsahu vody, neutrálnímu pH, přítomnosti polynenasycených mastných kyselin a citlivých aminokyselin. Vyvíjející se oxidace lipidů a proteinů, jakož i interakce mezi produkty oxidace mohou představovat důležitý problém během skladování. Informace o negativním účinku oxidace na kvalitu rybího filetu byly již zveřejněny několika autory, nicméně stále nejsou jasné dráhy a produkty oxidace proteinů kvůli různorodosti produktů oxidace proteinů. V této výzkumné práci byly zkoumány dráhy interakce lipidů a proteinů, cílové aminokyseliny, podmínky skladování a také konečný dopad na kvalitu svaloviny ryb. Zkoumali jsme kvalitu rybí svaloviny u kapra obecného a okouna za různých skladovacích podmínek (+ 4°C a -20°C). Také jsme porovnávali některé kvalitativní parametry ve svalovině okouna ze dvou různých chovných systémů, abychom identifikovali dráhy a produkty oxidace. Tato práce zkoumala, jak se oxidace vyvíjí s ohledem na reaktivní látky kyseliny thiobarbiturové a karbonyly jako markerů oxidace lipidů a proteinů, a jaký podíl mají polynenasycené mastné kyseliny na rozvoji oxidace lipidů. Dále byl zkoumán vliv podmínek skladování a oxidace na texturní a senzorické parametry. V průběhu postmortálních změn byly studovány možné změny pH, rigor index a biogenní aminy. Navíc jsme provedli proteomickou analýzu, abychom mohli hlouběji prozkoumat změnu proteinů a najít korelaci mezi strukturami proteinů a kvalitou svaloviny ryb. Naše výsledky prokázaly dobrou stabilitu u filetu kapra obecného (Cyprinus carpio) během 6 měsíců skladování při teplotě -20oC. Podle našich výsledků jsme po jednom týdnu zaznamenali výrazný pokles tuhosti svaloviny u kapra obecného a poté byla konstantní, zatímco ztráta tekutiny se výrazně zvyšovala s dobou skladování. Co se týče senzorických parametrů, nenarazili jsme ve zkoumaných parametrech na žádné rozdíly u uchovávaných syrových či vařených filetů ve srovnání s čerstvými. Ačkoli byly oba parametry oxidace lipidů (TBARS a PV) významně zvýšené, nedosáhly kritické úrovně z hlediska lidské konzumace. Na druhé straně se zásadně zvýšila oxidace proteinů, která se podílí na zhoršení kapacity zadržování vody. Dále jsme zkoumali kvalitu svaloviny u okouna říčního (Perca fluviatilis L.) ze dvou chovných systémů (RAS a rybník). Během mraženého a chlazeného uchovávání jsme pozorovali významné zvýšení množství TBARS a karbonylů v obou chovných systémech. Srovnání mezi oběma chovnými systémy neprokázalo žádné rozdíly v množství TBARS, zatímco koncentrace karbonylů byla významně vyšší u filetů pocházejících z RAS než u filetů pocházejících z rybníka, zejména před uplynutím 4 měsíců skladování při -20oC. Zaznamenali jsme také značný nárůst ztráty tekutin a výrazné snížení pevnosti filetů z obou chovných systémů. Naše výsledky prokázaly vyšší tuhost a ztrátu tekutin u filetů pocházejících z RAS ve srovnání s filety pocházejícími z rybníka. Proteomická analýza filetů z obou chovných systémů ukázala větší stabilitu u filetu pocházejícího z RAS během mraženého uchovávání, nicméně imunoblot odhalil více oxidovaných karbonylů u filetu pocházejícího z RAS než u filetů pocházejících z rybníka, obzvláště v čase 0 a 4. Tvorba ledových krystalů a akumulace ROS hraje pravděpodobně klíčovou roli ve vývoji oxidace během mraženého uchovávání, přičemž enzymová aktivita následovaná rozpadem proteinů je důležitá při chlazeném uchovávání.
|
|
|
Morfiem navozené změny membránových a solubilních bílkovin frontální mozkové kůry potkana
Ujčíková, Hana ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Mikšík, Ivan (oponent) ; Farghali, Hassan (oponent)
Cílem této dizertační práce bylo analyzovat změny indukované morfiem ve složení proteinů frontální mozkové kůry potkanů vystavených zvyšujícím se dávkám morfia po dobu 10 dní (10-50 mg/kg). První část práce byla zaměřena na fenomén superaktivace/hypersenzitizace adenylylcyklázy (AC), který je považován za jeden z klíčových molekulárních mechanismů podílejících se na vzniku patologických důsledků drogové závisloti. Vzestup aktivity AC představuje kompenzační odezvu funkčně spojenou se snížením odpovědi G proteinů vlivem dlouhodobé expozice morfiu. Výsledky naší pracovní skupiny již dříve prokázaly desenzitizaci odpovědi G proteinů při stimulaci opioidních receptorů (OR) agonisty DAMGO (µ-OR) a DADLE (δ-OR). Funkční aktivita G proteinů byla měřena pomocí vazby [35 S] GTPγS ve frakcích plazmatických membrán (PM) izolovaných z frontální mozkové kůry potkanů vystavených zvyšujícím se dávkám morfia podle stejného protokolu, jaký je uveden v této práci (10-50 mg/kg, 10 dní). κ-OR-stimulovaná vazba [35 S] GTPγS se nezměnila. Byl stanoven obsah všech typů izoforem AC (AC I-IX) ve frakcích PM izolovaných z potkanů ovlivněných morfiem a kontrolních zvířat usmrcených 24 hodin po aplikaci poslední dávky. Imunoblotová detekce byla provedena s využitím specifických protilátek orientovaných proti AC I-IX. Byl...
|
|
|
Morfiem navozené změny membránových a solubilních bílkovin frontální mozkové kůry potkana
Ujčíková, Hana
Cílem této dizertační práce bylo analyzovat změny indukované morfiem ve složení proteinů frontální mozkové kůry potkanů vystavených zvyšujícím se dávkám morfia po dobu 10 dní (10-50 mg/kg). První část práce byla zaměřena na fenomén superaktivace/hypersenzitizace adenylylcyklázy (AC), který je považován za jeden z klíčových molekulárních mechanismů podílejících se na vzniku patologických důsledků drogové závisloti. Vzestup aktivity AC představuje kompenzační odezvu funkčně spojenou se snížením odpovědi G proteinů vlivem dlouhodobé expozice morfiu. Výsledky naší pracovní skupiny již dříve prokázaly desenzitizaci odpovědi G proteinů při stimulaci opioidních receptorů (OR) agonisty DAMGO (µ-OR) a DADLE (δ-OR). Funkční aktivita G proteinů byla měřena pomocí vazby [35 S] GTPγS ve frakcích plazmatických membrán (PM) izolovaných z frontální mozkové kůry potkanů vystavených zvyšujícím se dávkám morfia podle stejného protokolu, jaký je uveden v této práci (10-50 mg/kg, 10 dní). κ-OR-stimulovaná vazba [35 S] GTPγS se nezměnila. Byl stanoven obsah všech typů izoforem AC (AC I-IX) ve frakcích PM izolovaných z potkanů ovlivněných morfiem a kontrolních zvířat usmrcených 24 hodin po aplikaci poslední dávky. Imunoblotová detekce byla provedena s využitím specifických protilátek orientovaných proti AC I-IX. Byl...
|
|
|
Proteomická analýza v hematologickém výzkumu: identifikace alfa2-makroglobulinu jako specifického vazebného proteinu pro hormon hepcidin a změny proteomu leukemických buněk K562 v průběhu indukované diferenciace butyrátem sodným.
Pešlová, Gabriela ; Vyoral, Daniel (vedoucí práce) ; Krijt, Jan (oponent) ; Suttnar, Jiří (oponent)
Dizertační práce: "Proteomická analýza v hematologickém výzkumu: identifikace alfa2-makroglobulinu jako specifického vazebného proteinu pro hormon hepcidin a změn proteomu leukemických buněk K562 v průběhu indukované diferenciace butyrátem sodným" je postavena na proteomickém přístupu k identifikaci a funkční charakterizaci proteinů, které se účastní transportu hormonu metabolismu železa, hepcidinu v krevní plazmě a které se uplatňují při erytroidní diferenciaci modelových buněk linie K562. V první části se jedná o proteomické využití nedenaturujících, nativních separačních metod, zejména chromatografie a nativní elektroforézy, ve druhé části pak o porovnání proteomu kontrolních a butyrátem indukovaných buněk pomocí klasické techniky - dvojrozměrné SDS polyakrylamidové elektroforézy. Metody použité v dizertaci rozšiřují spektrum technik použitelných v experimentální hematologii. Dizertace spolu s publikovanými články pak přináší poznatky o nových proteinech důležitých pro metabolismus železa a diferenciaci červených krvinek. Klíčová slova: proteomická analýza, hepcidin, alfa2-makroglobulin, metabolismus železa, CML, K562, Na-butyrát
|
host ::
RSS.